1.范围
本标准规定了玉米及其制品中伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3(以下简写为FB1、FB2、FB3)的测定方法。
本标准第一法为免疫亲和柱净化柱后衍生高效液相色谱法,第二法为高效液相色谱-串联质谱联用法,第三法为免疫亲和柱净化柱前衍生高效液相色谱法,适用于玉米及其制品中伏马毒素的测定。
第一法 免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱法
2.原理
样品用乙腈水溶液提取,经稀释后过免疫亲和柱浄化,去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。经高效液相色谱分离后柱后邻苯二甲醛衍生,荧光检测,外标法定量。
3.试剂和材料
除非另有说明,本方法使用的试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 甲醇(CH3OH):色谱纯。
3.1.2 乙腈(CH3CN):色谱纯。
3.1.3 乙酸(CH3COOH)。
3.1.4 氢氧化钠(NaOH)。
3.1.5 氯化钠(NaCl)。
3.1.6 磷酸氢二钠(Na2HPO4)。
3.1.7 磷酸二氢钾(KH2PO4)。
3.1.8 氯化钾(KCl)。
3.1.9 硼砂(Na2B4O7·10H2O)。
3.1.10 2-巯基乙醇(C2H6OS)。
3.1.11 邻苯二甲醛(OPA,C8H6O2)。
3.1.12 吐温-20(C58H114O26)。
3.2 溶液配制
3.2.1 甲酸水溶液(0.1%):吸取1mL甲酸,加入到999mL水中,混合均匀。
3.2.2 乙腈-水溶液(50+50):分别量取500mL乙腈和500mL水,混合均匀。
3.2.3 乙腈-水溶液(20+80):分别量取200mL乙腈和800mL水,混合均匀。
3.2.4 甲醇-乙酸溶液(98十2):吸取2mL乙酸,加入到98mL甲醇中,混合均匀。
3.2.5 氢氧化钠溶液(lmol/L):准确称取氢氧化钠4.0g,溶于100mL水,混合均匀。
3.2.6 磷酸盐缓冲液(PBS):称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾,用980mL水溶解,用盐酸调整pH至7.4,用水稀释至1000mL,混合均匀。
3.2.7 吐温-20/PBS溶液(0.1%):吸取1mL吐温-20,加入磷酸盐缓冲液(3.2.6)并稀释至1000mL,混合均匀。
3.2.8 硼砂溶液(0.05mol/L,pH10.5):称取硼砂19.1g,溶于980mL水中,用氢氧化钠溶液调pH至10.5,用水稀释至1000mL,混合均匀。
3.2.9 衍生溶液:称取2.0g邻苯二甲醛,溶于20mL甲醇中,用硼砂溶液(0.05mo/L,pH10.5)(3.2.8)稀释至500mL,加入2-巯基乙醇500μL,混匀,装入棕色瓶中,现用现配。
3.3 标准品
3.3.1 伏马毒素B1(FB1,C34H59NO15),纯度≥95%,或有证标准溶液。
3.3.2 伏马毒素B2(FB2, C34H59NO14),纯度≥95%,或有证标准溶液。
3.3.3 伏马毒素B3(FB3,C34H59NO14),纯度≥95%,或有证标准溶液。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 标准储备溶液(0.1mg/mL):分别准确称取FB1、FB2、FB3各0.01g(精确至0.0001g)至小烧杯中,用乙腈-水溶液(3.2.2)溶解,并转移至100mL容量瓶中,定容至刻度。此溶液密封后避光-20℃保存。有效期6个月。
3.4.2 混合标准溶液:准确吸取FB1标准储备液1mL、FB2和FB3标准储备液0.5mL至同一10mL容量瓶中,加乙腈-水溶液(3.2.2)稀释至刻度,得到FB1浓度为10μg/mL、FB2和FB3浓度为5μg/mL的混合标准溶液。再稀释10倍,得到FB1浓度为1μg/mL、FB2和FB3浓度为0.5μg/mL的混合标准溶液。此溶液密封后避光4℃保存,有效期6个月。
3.4.3 混合标准工作溶液:准确吸取混合标准溶液,用乙腈-水溶液(3.2.3)稀释,配制成FB1浓度依次为20ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、240ng/mL、320ng/mL、400ng/mL,FB2和FB3浓度依次为10ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、160ng/mL、200ng/mL的系列混合标准工作溶液。
4.仪器和设备
4.1 高效液相色谱仪,带荧光检测器。
4.2 柱后衍生系统。
4.3 天平:感量0.01g和0.0001g。
4.4 均质器。
4.5 振荡器。
4.6 氮吹仪。
4.7 离心机:转速≥4000r/min。
4.8 免疫亲和柱(柱容量≥5000ng,FB1柱回收率≥80%)(柱容量及柱回收率验证方法参见附录B)。
注:对于每个批次的亲和柱在使用前需进行质量检验。
4.9 微孔滤膜:0.45μm,有机型。
5.分析步骤
5.1 样品制备
将固体样品按四分法缩分至1kg,全部用谷物粉碎机磨碎并细至粒度小于1mm,混匀分成2份作为试样，分别装入洁净的容器内，密封，标识后置于4℃下避光保存。
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